宽视野荧光显微镜通常用于可视化生命科学标本中的结构并获得有用的信息。通过使用荧光蛋白或染料，可以以高度特异性的方式标记不连续的样品成分。为了完全理解结构，可能需要在3维上对其进行可视化，但是在使用显微镜进行成像时会面临某些挑战。

要创建结构的3D图像，必须考虑到光学器件的视场和景深有限，因此要获取来自对焦区域和离焦区域的信号信息。另外，可能发生衍射。散焦和散射光会导致形成“模糊”图像。

从历史上看，去卷积技术已用于消除散焦光。现在，有一种计算清算技术，它是一种创新的徕卡光电技术，超越了反卷积技术，可提供更清晰的图像和更逼真的结构3D表示。

问题：为什么图像模糊？

每个荧光显微镜用户都希望拥有尽可能多的感兴趣结构的详细信息。这里的问题在于光学系统产生逼真的图像的能力有限。所有光源，例如样本中的荧光蛋白，都会发出散射光。在实践中，根据样品的厚度，散射会导致信号模糊。为了克服这个问题，已经开发了不同的方法。

消除带针孔的焦点光

共聚焦显微镜通过在激发和发射光路中使用小孔的精密定位来排除离焦信息。这种方法导致较大的垂直（z）分辨率（较小的焦点深度），并消除了散焦信号的影响。由于样品中每个可视化点的共焦体积较小（光学切片），因此，在采集了样品的所有光学切片后便创建了最终图像。因此，更长的图像获取时间抵消了高分辨率的好处。

宽视野荧光显微镜

常规的宽视野显微镜没有针孔，并且可以同时收集焦点内和焦点外的光信号。它提供了快速的图像采集，但分辨率较低。

历史解决方案：通过反卷积获得更清晰的图像

为了了解如何解决宽视场图像中的模糊问题，从看一个很小的样本开始是有意义的，例如圆形乳胶珠，其尺寸低于显微镜的分辨率极限。用显微镜在横向（xy）方向观察此3D荧光样品，观察者会看到周围模糊的发光点投影（图1）。z堆栈的采集结果如下图所示：珠子的侧视图类似于两个圆锥体，它们彼此顶部重叠。此结果归因于杂散光，该杂散光在z堆栈采集期间记录。可以从信号数据中减去该“错误”信息，从而产生真正代表实际磁珠的图像。

使用宽视场显微镜在横向（xy）和垂直（xz）平面上点光源的投影

使用宽视场显微镜在横向（xy）和垂直（xz）平面上点光源的投影。非常小的发荧光的乳胶珠代表点光源。在此宽视场显微镜图像中无法再现其完美的圆形。由于杂散光，珠子的xy视图显示周围有些模糊。在获取z堆栈后，xz投影使该珠看起来像沙漏形状。用显微镜观察时，点对象的变形是普遍现象。

点扩散功能（PSF）

为了理解该过程的基础，有必要引入一个特殊术语，该术语在进行反卷积时经常使用：点扩展函数（PSF）。

原则上，图1中出现的变形现象是由于光学显微镜生成点光源的代表性图像的能力有限所致。穿过显微镜透镜的光信号会根据光学系统的设置，光的波长，物镜及其数值孔径（NA），浸没介质的折射率和其他参数而失真。所有这些影响的结果（与它们对光学系统产生的最终图像的影响有关）被描述为点扩散函数（图2A和2B）。从物理上讲，人们可以认为样品是被PSF缠绕（折叠）的。同时，通过了解PSF，可以从PSF中“展开”样品。这种“展开”称为反卷积。

用宽视野显微镜拍摄的点对象（非常小的圆形乳胶珠）的图像和z堆栈

用宽视野显微镜拍摄的点对象（非常小的圆形乳胶珠）的图像和z堆栈。图像受几个参数的影响，例如系统设置，数值孔径和浸没介质的折射率。导致图像失真的所有因素都可以通过点扩散函数（PSF）来描述。该对象可被认为是与PSF混淆的。如果知道PSF，则可以进行反卷积。

用共聚焦显微镜记录的非常小的乳胶珠的PSF

用共聚焦显微镜记录的非常小的乳胶珠的PSF。它是通过收集垂直（xz）平面中的强度生成的。PSF是一种衍射图，其核心形状控制着共聚焦显微镜的光学分辨率。

现在的问题是：如何确定PSF？通常通过计算来估计PSF。当提供诸如激发和发射波长峰值以及显微镜物镜的数值孔径（NA）之类的信息时，可以通过计算机算法来计算PSF的理论值。

超越反卷积：计算清算

徕卡显微系统公司的THUNDERImager技术可实时提供厚的生物样本的图像，并具有鲜明的对比度，而不会出现广角镜系统常见的雾霾或散焦模糊。它使用了一种称为计算清算的方法，该方法超越了反卷积方法。计算清算实时检测并消除了失焦区域中的有害信号，并清楚地揭示了感兴趣的聚焦区域中的所需信号。它通过样本特征尺寸的差异来区分散焦和聚焦信号。特征尺寸和所有相关的光学参数将自动考虑在内。对于通常不适合使用标准广角系统成像的标本，计算清除方法可以成功地以清晰的焦点和对比度可视化细节。而且，它可以与图像恢复方法结合使用。