荧光显微镜采用透射激发时，可以使用兰色光线根据普通明场照明法进行照明系统的调节，这包括光源调节及聚光镜中心的调节。如果采用暗场聚光镜，则还需要注意暗场聚光镜的使用及调节方法，当用兰色光线调节好后，就可采用更换滤色片的方法，使标本得到所需要的激发光线照射标本，但要注意使遏止滤光片已在光路中，这样可以保护观察者眼睛免受紫外线损伤。

荧光显微镜采用反射激发时，先在光路中加入绿色激发滤光片组，把照明可变孔径光阑与视场光阑完全打开，调节光源位置，使照明光束通过物镜转换器的螺孔中央并使光源成象于物平面上，此时物镜螺孔应是通孔（不装物镜）。检查激发光束是否通过物镜螺孔中央，可在螺孔端面上放置半透明纸观察光源光斑是否居中，在某些显微镜中，光源是在垂直面内调节其上下左右位置，而光源成象是通过集光镜沿轴方向移动来达到的。

荧光显微镜在安装光源时要注意光源表面不能沾污手指印及其他斑痕，以免点燃过后，难以清洁，因此，新安装光源时，使用前灯壳表面可用纱布蘸上酒精等有机溶剂揩檫干净，此外，还需要注意电极方向，根据光源要求进行安装，以免发生意外或点燃不亮，灯管应装入灯箱内方可点燃，以防万一爆炸伤人。激发滤光片及遏止滤光片如何组合使用应根据不同荧光标本的激发方法进行选择，一般也可根据使用说明书推荐的配套方法进行选用。