自然界中有许多发光过程。发光是发光不是高温导致的那些事件的总称。本文描述了不同形式的发光，并详细介绍了荧光的情况。在文章的第二部分中解释了描述荧光染料的相关技术术语，例如淬灭，漂白或量子产率，以深入了解荧光分子的基本特征。

徕卡荧光显微镜-发光过程

一些非常常见的生物学或生化实验室方法是基于几种“发光”的存在，例如磷光，化学发光，生物发光以及最终的荧光。作为荧光蛋白主题的介绍，可能需要更多地了解“荧光”。这些现象的起源是拉丁语see-escentia，它已经暗示了与我们视觉系统的联系。所有“…发光”都描述了我们可以用眼睛感知到的物理，化学或生物过程。我们在表示变化，动作或过程的词上添加后缀“…escent”，如恢复期。

因此很明显，荧光是我们可以看到的，并且与变化或过程有关。稍后我们将学习荧光如何满足这些条件。首先，我们将简要介绍一下其他本身都是发光的“…发光”。发光是发光的通称，不是高温的影响。因此，可以将发光确定为冷体辐射的外观。这种辐射可能是化学反应的一部分，也可能是亚原子运动或晶体应力的原因。产生辐射的另一种方法是白炽灯，其中物质由于热（例如，铁水）而发光。

化学发光是基于化学反应的发光过程，其中产物具有受激的中间体。当进入基态时，该中间体发光。与荧光不同，化学发光材料中的电子是通过化学反应而不是通过吸收光子来激发的。化学发光例如在荧光棒中找到了技术应用。众所周知的化学发光物质是鲁米诺，它在犯罪学领域用于发现血液痕迹。在此，存在于血红蛋白中的Fe2+离子起将Luminol变为其发光构型的催化剂的作用。

如果生物体发光，那么无论这种光如何产生，我们都说生物发光。有许多生物发光，例如萤火虫或萤火虫。杰克·奥兰登蘑菇（羊形眼线虫）是排在其他几种真菌中的非常特殊的生物，它在黑暗中发光。许多海洋生物，例如一些珊瑚，藻类，十字花科植物甚至鱿鱼，都发出光，大部分是蓝色或绿色的。另一个海洋居民是发光生物的水母维多利亚水母，绿色荧光蛋白（GFP）的来源。例如，萤火虫仅使用化学发光过程产生光，而维多利亚州使用化学发光和荧光过程。作为科学家发现，水母通过与蛋白质的帮助下发生化学反应生成蓝色光的水母发光蛋白。然后，该蓝光用于在荧光反应中激发已经提到的GFP，从而发出绿色光。

这就引出了一个问题：“什么是荧光？”荧光是一种物质吸收较短波长的光而发光的过程。波长的差异称为斯托克频移。详细地，如果物质吸收光子形式的光，则发生荧光。这导致电子转移到更高的能级。但是这种高能态非常不稳定，这就是为什么电子倾向于返回其基态的原因。在此过程中，能量再次以光子的形式释放，可以看作是辉光。与磷光相反，电子的能量迁移非常快，实际上在纳秒范围内（图1）。在用另一种不同的波长激发后能够发出不同波长的光的任何物质称为荧光染料。这些将在下一节中讨论。自然界中出现的大多数荧光物质都具有较宽的激发和发射光谱，但是具有明确定义的激发和发射最大值的物质对于荧光显微镜更为有用。

类似于荧光，磷光是一种发光现象，其中磷光材料被光激发。即使它与荧光密切相关，但速度要慢得多。与荧光相反，光子的重新发射通过激发电子能量与“禁止”状态的结合而减速。由于能量被“捕获”，它们返回基态的速度不像荧光灯那样快。磷光材料的典型示例是“黑暗中发光”玩具，可以用普通的灯泡或日光“充电”，然后发光几分钟甚至几小时。

徕卡荧光显微镜-荧光色素

如上所述，荧光染料是任何能够发出荧光的物质。在我们的情况下，荧光蛋白是荧光染料。在详细介绍之前，我们将介绍一些描述荧光蛋白的术语和表达。与荧光相关的非常常用的词是荧光团：荧光团是分子（例如蛋白质）中负责其荧光能力的部分。因此，GFP或其衍生物是与GFP或其衍生物相连的任何杂合蛋白（例如α-Tubulin-GFP）的荧光团。但是荧光团不必一定是蛋白质。FITC等小分子，TRITC（20个原子）或量子点（100–100,000个原子）等也是荧光团。

荧光蛋白的层次结构

深入观察荧光团，我们到达发色团，该发色团是定义其颜色的分子的一部分（图2）。在发色团内部，发生了电子的能级转换和相互关联的光发射（参见上文）。生色团至少有两种形式。它们是由共轭π电子共振系统（GFP）或金属络合物（叶绿素，血红素）构建的。

由于其与显微镜的相关性，我们将仔细研究GFP的发色团。事实证明，对于GFP生色团的形成，除了分子氧以外，不需要其他辅助因子或酶成分。由GFP氨基酸主链的一级结构定义，它以自催化折叠机制自发形成，并通过分子内重排完成。详细地说，发色团是由三种相关的氨基酸组成的。Ser65，Tyr66和Gly67经过环化，脱水和氧化先后。这些反应的结果是共轭π电子共振系统，GFP发色团。

从整个GFP结构来看，环状三肽位于圆柱体的中间。该圆柱体由11条链组成，形成β桶状结构，从而使蛋白质具有很高的稳定性。β桶结构的直径约为3nm，高度约为4nm（见图3）。迄今为止已知的所有FP均具有该保护筒，该保护筒对其光物理性质有很大的影响。在GFP的情况下，量子产率和光稳定性较高。此外，非常紧凑的蛋白质结构导致很高的抗pH值。带有GFP标签的样品在温度方面相对稳定，并且对变性物质如多聚甲醛，尿素或盐酸胍具有很高的耐受性。

绿色荧光蛋白（GFP）的分子结构

徕卡荧光显微镜-淬灭和漂白

但是，对于FP仍存在某些限制和限制，这将在下一节中提到。例如，淬灭过程以可逆的方式降低了荧光团的强度。这种衰减有多种原因。一方面，可能存在复杂的结构或内部转换。另一方面，淬灭可能是能量转移过程的结果。称为FRET的微观应用程序利用了此过程。在福斯特共振能量转移或荧光共振能量转移期间，供体荧光团D的能量转移至受体荧光团A。D的荧光减少，而A的荧光增加。

与淬灭是可逆的过程相反，存在不可逆的荧光减少过程，称为漂白。永久性荧光损失是基于长时间暴露于激发光会破坏荧光团。漂白量取决于强度，曝光时间和光源的能量。每个荧光团在漂白之前都有一定数量的激发和发射循环。对于GFP，每个分子可以被激发约104–105。这符合0.1–1s。

使用共聚焦激光扫描显微镜，光强度通常约为106W/m2。这种高能量剂量会产生过量的光子，从而导致许多荧光分子处于激发态的现象。在这种情况下，它们不再吸收正常波长的光。有了它，有效的染料浓度就降低了，换句话说，监视器上显示的像素不再是染料浓度的直接函数。与使用简单的弧光灯进行照明相反，使用高能激光会导致发射和激发之间存在非线性关系。

徕卡荧光显微镜-量子产率

谈到荧光蛋白的效率，我们应该提到量子产率。这是荧光团的另一个特征，比较光子的输入和输出。为了计算某种荧光团的量子产率，将发射的光子除以吸收的光子：

因此，对于100％的产率，量子产率将为1。用于激发的每个光子将在发射中产生一个光子。但是，这仅是理论值。实际上，激发所花费的光子要比发射光所吸收的光子多。例如，GFP的量子产率为0.6（参见表1）。换句话说，要在发射中获得6个光子，必须使用10个光子进行激发。

徕卡荧光显微镜-亮度

荧光蛋白的亮度是应用荧光显微镜检查时要考虑的另一个重要特征。根据显微镜的质量，此参数是实验成功的关键点。确定荧光蛋白亮度的一种客观方法是将其摩尔消光系数乘以其量子产率除以1,000。物质的摩尔消光系数告诉我们有关其在不同波长处的光吸收的信息。详细地，摩尔消光系数是在不同波长下，在1cm距离上具有摩尔浓度的物质吸收电磁辐射的尺寸。因此，对应的单位是M–1cm–1。

借助此计算，可以比较不同荧光蛋白的亮度。如果我们以摩尔消光系数为56,000M–1cm–1且量子产率为0.6的EGFP为例，则得出的值为33.6M–1cm–1。有时人们谈论荧光蛋白的相对亮度。在这种情况下，可通过将摩尔消光系数乘以量子产率，再除以EGFP的亮度值（33.6M–1cm–1）来计算亮度。通过这样做，可以将相对亮度转换为众所周知的EGFP，从而可以更快地比较不同的荧光蛋白。

徕卡荧光显微镜-光稳定性

许多荧光显微镜实验涉及活细胞的观察。考虑到淬灭和漂白等特性，很明显，生命细胞成像高度依赖于时间。即使在组织学或固定细胞样品的情况下，重要的是不要长时间照射样品和太强的光强度。描述感兴趣的荧光蛋白抵抗降解其荧光行为的机制的能力的参数是光稳定性。光稳定性表示为直到50％的初始亮度消失之前经过的秒数。为了进行比较，弧光灯提供的照明最大为10W/cm2，而激光等高强度光源（高达100W/cm2）可能会产生非线性影响。此外，为了测量和比较光稳定性，将荧光蛋白样品的pH值标准化为7.0，并使蛋白溶液的液滴适应典型哺乳动物细胞的大小。上述光源连续照明。并行地计算光子的发射。对于EGFP，它需要174秒的时间才能恢复到原来亮度的一半（Shaner等人，2005年）。换句话说，发射从1,000光子/秒减少到500光子/秒需要174秒。

知道某种荧光染料或蛋白质的不同特征（例如激发和发射最大值，亮度，量子产率等）后，实验人员便能够选择不同的候选物或观察条件，以满足其对特定实验设置的要求。此外，如果他知道不同荧光染料或蛋白质的光物理特征，则能够以详细的方式解释结果。