数字图像的空间分辨率与图像的空间密度和用于捕获图像的显微镜的光学分辨率有关。数字图像中包含的像素数量以及每个像素之间的距离称为采样间隔，这取决于数字化设备的精度。光学分辨率是对显微镜分辨原始样本中细节的能力的度量，除空间密度（数字图像中的像素数量）外，还与光学，传感器和电子设备的质量有关。 。在显微镜的光学分辨率优于空间密度的情况下，所得数字图像的空间分辨率仅受空间密度限制。

数字图像中包含的所有细节，从非常粗糙到非常精细，都是由亮度过渡组成的，该过渡在明暗级别之间循环。亮度转换之间的循环速率称为图像的空间频率，较高的速率对应于较高的空间频率。通过显微镜观察到的样品中亮度的变化水平是常见的，背景通常由均匀的强度组成，并且样品表现出光谱的亮度水平。在强度相对恒定的区域（例如背景），空间频率在整个视场中仅略有变化。另外，许多标本细节通常会表现出极度的明暗变化，其间存在很大的强度范围。

数字图像中每个像素的数值表示在采样间隔内平均的光学图像的强度。因此，背景强度将由相对均匀的像素混合组成，而样本通常包含的像素值范围从非常暗到非常亮。数码相机系统准确捕获所有这些细节的能力取决于采样间隔。在显微镜中看到的小于数字采样间隔（具有较高空间频率）的特征将无法在数字图像中准确表示。所述奈奎斯特准则需要一个取样间隔等于两倍的最高样本空间频率精确地保持所得到的数字图像中的空间分辨率。等效措施是Shannon的采样定理，指出数字化设备必须使用不大于光学图像最小可分辨特征尺寸一半的采样间隔。因此，要捕获样本中存在的最小细节度，必须以足够快的速率进行采样，以使每个特征至少要收集两个样本，从而确保空间周期的明暗部分都被样本收集。成像设备。

如果以比奈奎斯特准则或香农定理所要求的速度慢的速度对样本进行采样，则最终数字图像中将无法准确地表示具有高空间频率的细节。在光学显微镜中，光学图像分辨率的阿贝极限为0.22微米，这意味着数字化仪必须能够以与样品空间中0.11微米或更小的间隔进行采样。在每条水平扫描线的512个点对样本进行采样的数字化仪将产生约56微米（512 x 0.11微米）的最大水平视场。如果利用太少的像素来采集样本，那么包含样本的所有空间细节将不会出现在最终图像中。反过来，过度采样。从理论上讲，多余的像素不会对空间分辨率有所贡献，但通常可以帮助提高从数字图像获取的特征测量的准确性。为了确保为高分辨率成像提供足够的采样，建议最小可分辨特征的采样间隔为2.5到3个。

大多数与现代显微镜相连的数码相机都有固定的最大采样间隔，无法调整为与样本的空间频率匹配。选择能够满足显微镜放大倍率和样本特征的最低空间分辨率要求的照相机和数字转换器的组合非常重要。如果采样间隔超过特定样本所需的间隔，则生成的数字图像将包含比所需更多的数据，但是不会丢失空间信息。

在本教程中，随着“像素尺寸”滑块向右移动，数字图像的空间频率会线性降低。利用的空间频率范围从175 x 175像素（总共30,625个像素）到6 x 6像素（总共36个像素），以在频域内提供广泛的可能分辨率。当滑块向右移动（减少数字图像中的像素数量）时，将以越来越低的空间频率对样本细节进行采样，并且图像细节会丢失。在最低的空间频率下，会发生像素阻塞（通常称为pixelation）并掩盖大多数图像特征。