荧光显微镜的用途

荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。

荧光显微镜的使用步骤及使用方法

1、用窗帘遮蔽光线，关闭房间内的电灯，除去荧光显微镜的防尘罩，确保荧光显微镜灯室通风良好、无遮盖。装上汞灯灯箱，并转动灯箱卡圈上的拨杆，将灯箱与镜臂连接。

2、将汞灯灯箱的电源插头插入荧光电源箱后的插座，再将荧光电源箱的插头插入220V外接电源。

3、打开荧光显微镜电源开关，电压表显示出电源电压，如电源电压波动不大于额定电压值的5%，即可按下启动开关点燃汞灯，如因天气太冷或电压不稳定等原因，一次启动未点燃汞灯，可以多按几次。待超高压汞灯弧光达到稳定状态并达到Zda发光效率，即可开始工作。

4、灯泡的调中：

①任选一块标本放在荧光显微镜载物台上。

②转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移出光路，转动滤色片组转换手轮，将紫光(V)或蓝光(B)或绿光(G)激发滤色片组转入光路，并将25荧光物镜转入光路。

③调节粗微调手轮，将标本像调焦清晰。

④前后推动垂直照明器右边的聚光镜调焦推杆，使视场光栏成像清晰，转动视场光栏拨杆将视场光栏收小，调节视场光栏调中螺钉使视场光栏居中，然后再将视场光栏开至Zda。

⑤转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移入光路，前后调节灯箱上的聚光镜拨杆，使汞灯的弧光在视场内成像清晰。

⑥调整灯箱上的灯泡水平调节螺钉和垂直调节螺钉，使汞灯的弧光居中。

⑦调整反光镜水平调节螺钉和垂直调节螺钉，使光源的反射像与汞灯的弧光分开。

⑧转动聚光镜旋钮把聚光镜移出光路，此时视场照明均匀。

5、荧光观察：

①将荧光染色标本放到荧光显微镜载物台上。

②将10x平场物镜或25x荧光物镜转入光路，调节载物台纵横移动手轮，将标本移入光路。

③转动滤光片转换拨轮，将荧光染色标本所需要的激发滤光片组转入光路。激发滤光片组编号刻在滤片组转换拨轮上。滤光片选择正确与否，是荧光显微镜能否得到正确应用的关键。选用滤光片时，必须遵守斯托克斯定律：激发滤光片的透射波长<双色束分离器的透射波长<阻断滤光片的透射波长。

④调节粗调手轮，当看清荧光图像轮廓后，再用微调手轮调焦，直至看到清晰的荧光图像。

⑤当需要得到较强的荧光图像时，可转动聚光镜旋钮把聚光镜移入光路，可获得较明亮的荧光图像。

⑥当需要使用40x或100x荧光物镜观察时，应在标本和物镜间加上甘油，油中不能有影响观察的小泡或杂质。使用时可使甘油慢慢浸润一会儿，然后轻轻左右来回转动物镜转换器以排除气泡。

6、荧光显微摄影

由于荧光图像一般均较明场观察暗得多，所以进行荧光显微摄影需要较长的曝光时间，在曝光时应注意避免荧光显微镜震动。为了缩短曝光时间，可选择倍率较低的摄影目镜或感光度较高的摄影胶片如ASA200以上或DIN24以上。

荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易褪色减弱，要即时摄影记录结果。方法与普通显微摄影技术基本相同。因紫外光对荧光猝灭作用大，如FITC的标记物，在紫外光下照射30s，荧光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微摄影系统装置。

7、荧光图像的记录方法

荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将二者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标，即凭工作者目力观察。作为一般定性观察，基本上是可靠的。

8、荧光显微镜使用结束，关闭所有电源，做好镜头和载物台的清洁工作，待灯室冷却至室温后，用防尘罩盖好显微镜，并做好使用记录。

奥林巴斯荧光显微镜操作使用步骤

1、使用前确保你已经熟悉显微镜的基本操作，否则不允许操作。

2、先开电源（ON），启动发光器，再开照相机电源。以免先照相机再开荧光显微镜电源时，强大电源将照相机电子零件烧损。

3、在显微镜下找到需要的物象后，打开电脑的成像系统。需要使用荧光时，请务必预热荧光灯电源15分钟。

4、选择滤镜，将滤镜推入（以免光线向外散失）后，于暗室下开始观察。应一次把全部玻片观察完毕，勿中途切断电源，否则须待冷却后（约30分钟）才能再开电源。最少开机30分钟才可关机，以免缩短灯泡寿命。

5、荧光色素于普通光线照射下易消失，故未观察之标本宜置不透光盒内储存于冰箱（4～5℃）。而在荧光显微镜之紫外线照射下亦易使荧光消失，故照像宜速。

6、等冷却后，再将防尘罩罩上。

7、测试完毕后，请认真填写登记表格。

8、本区春夏气候潮湿，存放荧光显微镜暗室应有除湿设备，并每星期将荧光显微镜至少开机一次，以免显微镜发霉损及镜头与滤光镜。

倒置荧光显微镜操作使用步骤：

a、相差观察：

打开明场电源开关（“︱”为开，“○”为关）

将样品置于载物台上

将光路选择旋钮调至观察位置

从低倍镜开始观察，调节到与镜头相匹配的相差环，荧光滤块转盘拨到“1”的位置

调节透射光光强，调节焦距，找到预观察视野

依次换到高倍镜，（注意调节相差环）观察样品

拍照时将光路选择旋钮调至相机位置

b、荧光观察：

打开明场电源开关

打开汞灯开关

将样品置于载物台上

将荧光光路shutter打开（“○”为开，“●”为关），需保护样品时关闭shutter

将光路选择旋钮调至观察位置

根据样品的标记情况将荧光滤块转盘转到相应的位置

通过两组减光滤片调节激发光强度

从低倍镜开始观察，调焦，找到预观察视野，

依次换到高倍镜头，观察样品

拍照时将光路选择旋钮调至相机位置

c、普通明场观察：

打开明场电源开关（“︱”为开，“○”为关）

将样品置于载物台上

将光路选择旋钮调至观察位置

从低倍镜开始观察，相差环拨到明场（BF）位置，荧光滤色块转盘拨到“1”的位置

调节透射光光强，调焦，找到预观察视野

依次换到高倍镜，观察样品

拍照时将光路选择旋钮调至相机位置

d、关机：

关闭汞灯电源（注意：汞灯需使用半小时以上方可关闭，关闭半小时以后方可再次开启）

将透射光强调到最小，透射光选择按钮按出

关闭明场电源开关

将镜头转到低倍镜，取出样品，若使用过油镜用干净的擦镜纸擦拭镜头

确认数据已经保存，关闭软件

使用光盘拷贝数据（禁止使用移动储存设备拷贝数据）

关闭电脑，登记使用时间、荧光数字等使用情况

荧光显微镜使用方法：

(1)将物料板放在舞台上。

（2）打开调节器荧光显微镜。然后按下启动一套UV灯不能接近15分钟内点燃，后收盘不能重新启动3分钟。

（3）将激励滤波器转换为V，将分色器调整为V，选择495或475nm阻塞滤波器。

(4)使用uvfl40、uvfl100萤光镜检查。

(5)将非荧光油加入到载玻片上，首先使用40X，然后用100X聚焦显微镜检测荧光。

（7）由于在由随时间推移的UV荧光增加照射荧光物质逐渐减弱，因此应不断变化的视野检查。

（8）紫外FL10或紫外FL20也可用作低倍显微镜材料（使用低倍显微镜时不加荧光油）。

荧光显微镜使用注意事项

1、严格按照荧光显微镜说明书要求进行操作，不要随意改变程序。

2、荧光显微镜应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。

3、防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。

4、检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱;标本受紫外线照射3～5min后，荧光也明显减弱;所以，Z多不得超过2～3h。

5、荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。

6、标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。

7、荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“-”表示无或可见微弱荧光。“+”表示仅能见明确可见的荧光。“++”表示可见有明亮的荧光。“+++”表示可见耀眼的荧光。

荧光显微镜标本制作要求

1、载玻片

载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。

2、盖玻片

盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质(如氟化镁)的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光方可激发标本。

3、标本

组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。

4、封裱剂

封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5~9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/lpH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。

5、镜油

一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，Z好使用特制的无荧光镜油，也可用甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。

荧光显微光学系统需要优先考虑的是:

(1)光学系统组成的材料应选用在激发光波内无荧光材料,不但指光学系统玻璃也包括胶合制造中的胶合剂、切片、盖玻片和浸液以及密封剂。若有自发荧光,不但会增加背景光,有时还会混淆观察荧光图像。

(2)光学系统的参数选择中,应将获得更大光能作为首考虑因素。

照明系统中集光镜应选用更大的包容角;采用柯勒照明并使灯丝或弧光像充满入瞳,以期望获得高效率的均匀照明。

收集荧光成像的物镜,因为像面照度与数值孔径NA2成正式,为此作为荧光用物镜应有较大的NA值。目前10×已达015;20×达0175;40×达019;油镜40×达113。

双目镜筒作为荧光用时应在可见光谱段有较高的透过率,采用镀膜技术可大大地减少光能的损失,它可比一般双目镜筒透射率提高一倍,这对弱荧光物质观察是必须的。

目镜放大率不宜选大,因为象面照度与目镜放大率平方成反比。若其它条件相同,当用613×目镜时,照度定为100,换上1215×时,照度约为25%,因此常在4×～613×之间选用。

由此表明,用不同物镜和目镜组合成同一倍率的显微镜时,象面照度和曝光系数可相差数倍,对于荧光观察更佳组合是选用低倍率目镜和NA大的物镜更为合适。

(3)作为荧光光学系统各组成部件的光谱特性也是至关重要的,特别是紫外光要通过的部件,如照明系统,聚光镜以及物镜,要关注紫光区的透射系数。聚光镜要选用透紫外线的材料。照明系统中反光镜表面镀铝比镀银好,因为铝在UV和V区反射率在90%以上,而银仅达70%。加拿大胶吸收紫外线,在紫外区通过处不宜用作胶合剂。